質譜在蛋白質鑒定和其他實驗中起著重要作用，然而，目前的應用并不是特別廣泛。輝駿生物收集了以下一些質譜鑒定的常見問題，希望對您的質譜鑒定實驗更好的理解有所幫助：

Q1：一級質譜儀和二級質譜儀有什么區(qū)別？  以及如何選擇合適的？
A：質譜鑒定的主要手段主要是指肽質譜指紋圖譜（PMF），即應用質譜法準確測量酶促片段的分子量和比對鑒定蛋白質的文庫，對肽段序列進行鑒定，結合PMF結果，實現(xiàn)對蛋白質的鑒定。   二級質譜可以得到部分肽段的短序列，可靠性更高。隨著當前期刊對數(shù)據(jù)要求的日益嚴格，二級質譜鑒定是蛋白質鑒定的一大趨勢，即使目前進行質譜鑒定，有必要選擇一些 PMF 結果進行二級質譜驗證。

Q2：如果研究的物種不是模式生物，應該怎么做？
A：通過參考親緣關系最近的模式生物，可以成功鑒定出蛋白質。  如果質譜圖很好但沒有鑒定結果，則表明這可能是一種全新的蛋白質。  從頭等技術可用于深度分析和識別。

Q3：如何評價質譜的有效性？
A：PMF評分超過60分（P<0.05）一般認為是成功的。  對于串聯(lián)質譜，得分超過 60 分或雖然不超過 60 分，但至少有一個得分超過 30 分的肽將被成功鑒定。

Q4：一些特殊的質譜方法有什么用途？
A：質譜的其他用途包括磷酸化位點分析、蛋白質測序、混合蛋白質鑒定（鳥槍技術）、準確測定分子量、二硫鍵位置分析等。

Q5：哪種染色方法比較好？
A：考馬斯亮藍染色是首選。  銀染也可以，但鑒定成功率略低，使用串聯(lián)質譜法鑒定銀染蛋白可以大大提高鑒定成功率。

Q6：凝膠可以長期保存嗎？  如何保養(yǎng)？  會不會影響識別效果？
答：如果凝膠保存超過一個月，應該用保鮮膜包裹并保存在冰箱中。  如果時間小于1個月，可以在室溫下保存，不影響質譜分析。

Q7：質譜的凝膠點怎么取？  有什么預防措施嗎？
A：取穴時，將0.2ml吸頭的尖端剪斷，用移液器吸頭取出凝膠，轉移到0.5ml離心管中。  用水沖洗珠子兩到三次，然后吸干管子。  保持所有防潮密封件就位并標記它們。  離心管最好選用進口離心管，避免塑料污染。   最好使用去離子水或雙蒸水。  帶上口罩和手套以防止角蛋白污染。

Q8：凝膠可以長期保存嗎？  如何儲存和運輸？
A：蛋白膠可以長期保存，不影響質譜鑒定。  一般來說，如果是一兩周內(nèi)，最好用保鮮膜包好，存放在4度的冰箱里。   若保存時間超過1個月，可將蛋白斑點取出，置于-20℃或-80℃冰箱中，不影響后續(xù)質譜鑒定。  運輸膠點時，可以常溫運輸，三到五天不會有太大影響。

Q9：一級質譜和二級質譜如何選擇？
答：主要的質譜鑒定方法通常稱為肽質量指紋 (PMF)。  二級質譜鑒定方法通常稱為串聯(lián)質譜。   早期蛋白質鑒定，考慮到成本，測序生物的蛋白質鑒定一般可以用一級質譜儀來完成，而非測序的生物往往選擇二級質譜儀。   但現(xiàn)在，二級質譜儀的價格也大大降低，與一級質譜儀的價格相差不大，無論是可靠性還是識別成功率都有很大的提高。

Q10：質譜的一般流程是什么，企業(yè)可以提供哪些數(shù)據(jù)？
A：質譜鑒定主要包括三個步驟：蛋白水解、質譜數(shù)據(jù)采集、庫檢索。   對于每個蛋白點的識別，一般提供三類數(shù)據(jù)，包括：質譜圖（PDF格式，包括1張一級質譜和5-10張二級質譜）、質譜峰列表（文本格式，主要部分MS片段信息）和搜索結果（自建庫通用PDF格式或excel格式本地化搜索；Mascot在線搜索通用網(wǎng)頁格式）。

Q11：影響質譜結果的一般因素有哪些？
A：質譜鑒定不成功主要分為兩類。  一個原因是質譜無效，另一個是沒有參考數(shù)據(jù)的蛋白質數(shù)據(jù)庫。  導致質譜結果不成功的原因可細分為：（1）蛋白點過淺，蛋白含量過低；   (2)蛋白點太小，不利于操作；  （3）雖然用二維電泳分離，但重點是幾種蛋白質的混合物；  (4)蛋白水解和質譜誤差。

為避免這些因素，需要取較暗的蛋白點，蛋白點面積需要適當大一些（對于一些小但非常清晰的蛋白點，應選擇孔徑較大的樣品尖端。邊緣上的空白是否被正確拾取并不重要）。  避免點混合蛋白斑點，在酶解和質譜分析方面擁有豐富的經(jīng)驗。   通過更換較大的數(shù)據(jù)庫，取EST數(shù)據(jù)庫，在單一物種蛋白質數(shù)據(jù)庫的基礎上建立本地質譜數(shù)據(jù)庫，可以解決因沒有參考數(shù)據(jù)庫而導致鑒定結果不佳的問題。

Q12：串聯(lián)質譜和質譜測序有什么區(qū)別？
A：質譜鑒定通常使用軟件自動匹配現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫以獲得結果。  而質譜測序需要根據(jù)質譜圖中相鄰或相似峰的分子量差異直接計算肽序列。

Q13：未知蛋白質是質譜測序還是蛋白質測序儀測序？
A：比較簡單的方法是質譜，成本也不貴。  如果質譜不能確定，也可以結合N端測序。  這兩個數(shù)據(jù)組合分析基本可以確定目標蛋白。