circRNA pull down技術(shù)多依賴接口序列設(shè)計(jì)探針捕獲circRNA及結(jié)合蛋白，但受限于序列特征，多數(shù)circRNA難以設(shè)計(jì)理想探針，易致實(shí)驗(yàn)失敗。輝駿生物研發(fā)新型circRNA pull down方法（已獲國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)），通過構(gòu)建circRNA過表達(dá)載體，為circRNA連接16nt短RNA序列標(biāo)簽F2，該標(biāo)簽與其特異性配體親和力強(qiáng)，可高效調(diào)取靶RNA及結(jié)合蛋白。后續(xù)可借助western blot、LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)合蛋白，通過qPCR檢測(cè)結(jié)合靶circRNA的miRNA。

圖：circRNA pull down發(fā)明專利證書—輝駿生物

輝駿生物在本文將圍繞circRNA pull-down技術(shù)原理、流程、注意事項(xiàng)、結(jié)果解讀、文獻(xiàn)應(yīng)用及常見問題與解決方案展開詳解，技術(shù)咨詢或產(chǎn)品訂購(gòu)可隨時(shí)聯(lián)系。

circRNA pull down實(shí)驗(yàn)原理

通過將 F2 標(biāo)簽序列與目標(biāo) circRNA 序列連接，構(gòu)建成 F2-circRNA 過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染并裂解目的細(xì)胞，之后采用特異性配體磁珠來調(diào)取 F2-circRNA 及其結(jié)合蛋白或結(jié)合 RNA。去除未結(jié)合的物質(zhì)后，洗脫下來的蛋白質(zhì)可通過western blot或LC-MS/MS檢測(cè)，或提取 RNA 進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

circRNA pull down實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果

1 F2-circRNA 過表達(dá)細(xì)胞制備

(1) 將 F2 標(biāo)簽序列（GGCGCTGACAAAGCGCC）分為兩部分，分別連在 circRNA 接口處首尾（例如AAAGCGCC 連在 circRNA 頭部，GGCGCTGAC 連在 circRNA 尾部），并將此序列構(gòu)建至 circRNA 表達(dá)載體中，只有當(dāng)載體上的 circRNA 在細(xì)胞內(nèi)首尾連接成環(huán)后，才能在接口處形成完整的 F2 標(biāo)簽，避免了線性序列的干擾。

(2) 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)會(huì)天然轉(zhuǎn)錄得到帶 F2 標(biāo)簽的目標(biāo) circRNA（對(duì)照組用空載體表達(dá)細(xì)胞）。

(3) qPCR 檢測(cè) F2-circRNA 的表達(dá)情況。

2 樣本裂解

(1) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取 2*10e7個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS（RNase-free）清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 4°C 500 g 離心5 min 收集細(xì)胞沉淀，徹底去除培養(yǎng)基成分；

(2) 將樣本置于冰上，每組加入 500 μL 預(yù)冷的裂解緩沖液（輝駿貨號(hào)：FI8101）、5 μL 蛋白酶抑制劑（輝駿貨號(hào)：FI8105）和 2.5 μL RNA 酶抑制劑（輝駿貨號(hào)：FI8106），吹打混勻；

(3) 為了更充分裂解，最好冰上超聲至溶液基本澄清；如果無超聲條件，可置于冰上裂解 30 min，期間每 10 min渦旋混勻一次，每次 5 s；

(4) 4℃ 12000 g 離心 15 min，收集上清至新的離心管中；

(5) 取 30 μL 作為 input，剩余置于冰上備用或- 80℃保存。

圖3 circRNA pull-down實(shí)驗(yàn)分組圖

(1) 將磁珠上下顛倒混勻，取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組一共所需的 80 μL 磁珠到新的離心管中；

4 circRNA pull-down

(1) 將制備好的細(xì)胞裂解液加入相應(yīng)組別的磁珠中，混勻儀上 4°C 孵育 2~4 h；

(2) 放磁力架上靜置 1 min 并棄上清；

(3) 每組加入 500 μL 漂洗液（步驟 3 準(zhǔn)備），顛倒混勻 30 次，放磁力架上靜置 1 min 并棄上清；

(4) 重復(fù)上步操作兩次，共漂洗三次，保留磁珠。

5 蛋白洗脫

如果需要對(duì) pull down 產(chǎn)物進(jìn)行蛋白檢測(cè)，可以在以下方案中選擇合適的洗脫方法。

5.1 非變性洗脫 

向磁珠中加入50 μL洗脫緩沖液（輝駿貨號(hào)為：FI8102），渦旋振蕩20 s，放混勻儀上室溫洗脫10-15 min；渦旋振蕩20 s，1000 g離心20 s；放磁力架上靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，-80℃保存。該洗脫產(chǎn)物保持原有的生物活性，適用于后期各種檢測(cè)，例如質(zhì)譜、SDS-PAGE 或 Western-blot 等。

5.2 變性洗脫

注意：RNA pull-down捕獲的蛋白量通常較少，因此SDS-PAGE膠建議用硝酸銀染色，檢測(cè)富集蛋白的情況。

聯(lián)系技術(shù)支持

18927549347、13430303037

結(jié)果解讀

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：檢測(cè)細(xì)胞中的目標(biāo) circRNA 與待測(cè)蛋白（Prey）是否存在相互作用。

(1) Input_NC：空載對(duì)照組細(xì)胞的裂解液；

(2) Input_F2-cirRNA：過表達(dá) F2-circRNA 細(xì)胞的裂解液；

(3) circRNA pull-down_NC：空載對(duì)照組細(xì)胞的 circRNA pull-down 產(chǎn)物；

(4) circRNA pull-down_F2-cirRNA：過表達(dá) F2-circRNA 細(xì)胞的 circRNA pull-down 產(chǎn)物。

6. RNA 提取純化

如果需要對(duì) pull down 產(chǎn)物進(jìn)行 RNA 檢測(cè)，可以購(gòu)買微量 RNA 提取試劑盒或按照以下步驟提取 RNA。

(1) 向磁珠中加入 1 mL Trizol，室溫靜置 5 min，4 ℃ 12000 g 離心 10 min，取上清；

(2) 加入 0.2 mL 氯仿，渦旋混勻或猛烈晃動(dòng) 15 s，室溫放置 2~3 min；

(3) 4 ℃ 12000 g 離心 15 min，吸取水相至新的無 RNase 離心管中（約可吸取 0.5-0.55 mL）；

(4) 加入 0.5 mL 異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫下沉淀 10 min 或 -20 ℃ 沉淀過夜；

(5) 4 ℃ 12000 g 離心 10 min，管底可見 RNA 沉淀，棄上清；

(6) 加入 1 mL 75%乙醇（DEPC 水或 RNase-free 水配制）；

(7) 4℃ 12000 g 離心 10 min，棄上清；5000 g 快速離心 1 s，小心吸盡液體；

(8) 待 RNA 略干后，加入 20 μL DEPC 水或 RNase-free 水溶解，- 80 ℃保存或直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

注意：RIP 后的 RNA 一般較微量，操作時(shí)注意勿把 RNA 沉淀吸走；切勿讓 RNA 過分干燥，否則將極難溶解，且測(cè)出的 A260/280 值會(huì)低于 1.6。

Q：獲得的蛋白復(fù)合產(chǎn)物少？

A：①可能是樣本蛋白量不夠，可提高樣本用量；

②可能是孵育時(shí)間不夠，延長(zhǎng)孵育時(shí)間(如孵育過夜)，但需要注意孵育時(shí)間過長(zhǎng)也可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增多。

Q：如何減少非特異性蛋白的結(jié)合？獲得的復(fù)合物雜蛋白多

A：可能是非特異性的蛋白結(jié)合在磁珠上，可通過增加漂洗時(shí)間和次數(shù)，或?qū)颖具M(jìn)行預(yù)處理：先與磁珠孵育，去除非特異結(jié)合蛋白。

在2025年Molecular neurobiology雜志上發(fā)表了一篇關(guān)于關(guān)于整合素連接激酶（ILK）在腦缺血再灌注損傷（CIRI）所引發(fā)的神經(jīng)元凋亡過程中的作用研究的文章，作者使用了輝駿生物circRNA Pull-Down 試劑盒（貨號(hào)：FI8710），利用F2標(biāo)簽對(duì)circ0000964進(jìn)行了標(biāo)記，circRNA Pull-Down 實(shí)驗(yàn)來分析circ0000964、miR-758-3p 和 ILK 在大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中的相互作用。

作者探究靶circ0000964是否通過互作的RNA（miR-758-3p ）調(diào)控ILK表達(dá)，通過富集的circ0000964和 miR-758-3p 的水平升高，表明它們之間存在直接相互作用（圖C、D）。此外，mRNA 分析顯示，circ0000964與 miR-758-3p 的水平呈負(fù)相關(guān)，這反過來又影響了 ILK 的表達(dá)（圖 E）。

輝駿生物circRNA pull down實(shí)驗(yàn)服務(wù)內(nèi)容

1、circRNA pull-down WB（驗(yàn)證型）

客戶提供

1.實(shí)驗(yàn)樣本；

2.circRNA序列的質(zhì)粒模板；

3.待測(cè)蛋白抗體；

4.實(shí)驗(yàn)信息表。

我們提供

1. circRNA-F2載體構(gòu)建和成環(huán)檢測(cè)，包括載體質(zhì)粒及測(cè)序結(jié)果、qPCR檢測(cè)結(jié)果、構(gòu)建和檢測(cè)詳細(xì)報(bào)告；

2. circRNA-F2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞和表達(dá)效率檢測(cè)，即qPCR的檢測(cè)結(jié)果；

3. circRNA pull down調(diào)取目標(biāo)circRNA及其結(jié)合蛋白，包括circRNA的qPCR檢測(cè)結(jié)果、待測(cè)蛋白的Western blot檢測(cè)圖、Pull down實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

2、circRNA pull-down MS（篩選型）

客戶提供

1. 實(shí)驗(yàn)樣本；

2. circRNA序列的質(zhì)粒模板；

3. 實(shí)驗(yàn)信息表。

我們提供

1. circRNA-F2載體構(gòu)建和成環(huán)檢測(cè)，包括載體質(zhì)粒及測(cè)序結(jié)果、qPCR檢測(cè)結(jié)果、構(gòu)建和檢測(cè)詳細(xì)報(bào)告；

2. circRNA-F2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞和表達(dá)效率檢測(cè)，即qPCR檢測(cè)結(jié)果；

3. circRNA pull down調(diào)取目標(biāo)circRNA及其結(jié)合蛋白，包括circRNA的qPCR檢測(cè)結(jié)果、蛋白SDS-PAGE銀染檢測(cè)圖、Pull down實(shí)驗(yàn)報(bào)告；

4. LC-MS/MS檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析，包括質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果及報(bào)告、互作蛋白篩選表格、生物信息學(xué)分析結(jié)果和報(bào)告。

輝駿生物10多年RNA和蛋白研究經(jīng)驗(yàn)，已掌握先進(jìn)的 circRNA pull-down 技術(shù)，幫助您識(shí)別 miRNA/RBP 和 circRNA 之間的相互作用。每個(gè)項(xiàng)目都是完全定制的，以滿足您的科學(xué)需求，經(jīng)驗(yàn)豐富的團(tuán)隊(duì)可以為您提供靈活的解決方案，以更快的時(shí)間和更低的價(jià)格給您最可靠的服務(wù)。此外，我們還提供circRNA pulldown試劑盒，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低，眾多客戶使用后已高效完成circRNA pull down實(shí)驗(yàn)！

售后技術(shù)支持將一直保持到文章發(fā)表，確保您安心進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿。如果您對(duì)circRNA pull-down有任何實(shí)驗(yàn)問題，可與輝駿聯(lián)系：4006991663！