蛋白質鑒定方法

蛋白質鑒定這里的是指利用一定的生化和物理方法對蛋白質進行準確的篩選和鑒定。 傳統(tǒng)的蛋白質鑒定方法，包括免疫印跡、已知或未知蛋白質的復合分析以及內肽的化學測序，都復雜、耗時且準確度較低。

蛋白質鑒定方法已經從圖像分析技術、微量測序、氨基酸組成分析發(fā)展到質譜分析。  圖像分析技術使用光譜儀。  整個過程涉及到一些斑點的檢測、背景扣除、斑點匹配和數(shù)據庫的構建。  圖像分析和氨基酸組成分析需要結合其他蛋白質鑒定技術來完成整個過程。  微測序技術更新迅速，實現(xiàn)了蛋白質自動識別的目標。   如今，研究人員越來越傾向于選擇質譜相關技術進行快速蛋白質鑒定。

質譜鑒定蛋白質的不同方法

質譜儀可以將肽指紋和肽片段的測序結果與蛋白質數(shù)據庫中蛋白質的理論肽質量指紋（PMF）進行比較，以尋找最佳候選蛋白質。  與質譜相關的蛋白質鑒定方法包括基于 MALDI-TOF 的蛋白質指紋識別和基于 LC-MS/MS 的肽測序。

• MALDI-TOF / MS

(1) MALDI-TOF/MS的原理

MALDI-TOF 是一種基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀。  基于 MALDI-TOF 的蛋白質指紋圖譜法用于用某種蛋白水解酶（通常是胰蛋白酶）消化樣品并獲得 MS 譜，從而生成所有肽（或 MH+）的質量。   這些質量用作指紋以在數(shù)據庫中搜索蛋白質并匹配測量的質量。  與最高分匹配的蛋白質為候選蛋白質。

圖 1. MALDI-TOF 質譜分析過程

(2) MALDI-TOF/MS的優(yōu)勢

MALDI-TOF/MS 的優(yōu)勢在于高精度的離子反射器和延遲離子提取，這使得它可以快速收集 MALDI-TOF/MS 數(shù)據并分析結果。

(3) MALDI-TOF/MS的應用

主要用于臨床醫(yī)學、食品工業(yè)和動植物檢疫中微生物的鑒定和分類。

• 液相色譜-質譜/質譜

(1) LC-MS/MS的原理

高效液相色譜-質譜聯(lián)用系統(tǒng)可以通過分析物質的分子量和元素組成來研究分子結構等信息。  在通過 LC-MS/MS 肽測序鑒定蛋白質期間，蛋白水解消化（通常是胰蛋白酶消化）中的肽混合物通過 HPLC 進行分離。  串聯(lián)質譜儀和 HPLC 用于進行肽片段化。  獲得每個碎片肽段的 MS/MS 譜圖（通常每個樣品有數(shù)千個 MS/MS 譜圖）。  每個 MS/MS 譜圖（對應于特定的肽段序列）用于搜索蛋白質數(shù)據庫中的匹配肽段，以最終識別蛋白質。   尤其是反相液相色譜和串聯(lián)質譜（串聯(lián)質譜）的結合，可以在幾十皮摩爾的水平上進行檢測。   如果毛細管色譜與串聯(lián)質譜相結合，可以檢測到低濃度、低于飛摩爾水平和原子水平的蛋白質。   目前，蛋白質的鑒定多采用酶水解、液相色譜分離、串聯(lián)質譜和計算機算法相結合的方法。

圖 2. 與液相色譜 (LC-MS/MS) 相關的串聯(lián)質譜圖

(2) LC-MS/MS的優(yōu)勢

LC-MS/MS 可以以高靈敏度和特異性分析中小極性分子。

(3) LC-MS/MS的應用

LC-MS/MS 可以確定蛋白質分子量，分析肽段和蛋白質修飾位點，并鑒定蛋白質。  可用于生物化學、農業(yè)和臨床醫(yī)學等領域。

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