成功培養(yǎng)原代嚙齒動(dòng)物神經(jīng)元的7個(gè)技巧

原代神經(jīng)元培養(yǎng)物是研究細(xì)胞功能、蛋白質(zhì)相互作用和神經(jīng)毒性的有力工具，并有助于許多其他體外應(yīng)用。培養(yǎng)神經(jīng)元的一些最大挫折可能是獲得低細(xì)胞產(chǎn)量和管理細(xì)胞死亡。優(yōu)化你的神經(jīng)元準(zhǔn)備工作流程也可能既費(fèi)時(shí)又費(fèi)錢。輝駿生物的蛋白質(zhì)技術(shù)人員在下文提供七個(gè)技巧，或許能幫助提高你的初級(jí)神經(jīng)元培養(yǎng)物的完整性。

1. 創(chuàng)建具有理想基材的矩陣

2. 使用胚胎組織

3. 充分分離你的組織

4. 確保使用含有正確補(bǔ)充劑的無(wú)血清培養(yǎng)基

5. 了解適合你實(shí)驗(yàn)的密度

6. 快速工作

7. 讓你的文化適應(yīng)新環(huán)境

圖：神經(jīng)元準(zhǔn)備的一般工作流程

1. 創(chuàng)建具有理想基材的矩陣

神經(jīng)元與塑料或玻璃的單層附著需要細(xì)胞外基質(zhì)成分和其他粘附因子，尤其是由于它們的無(wú)血清環(huán)境。為了確保你的神經(jīng)元在培養(yǎng)物中正確粘附、分化和生長(zhǎng)，請(qǐng)務(wù)必在電鍍細(xì)胞之前用一種或多種底物覆蓋你的平板。神經(jīng)元培養(yǎng)最常用的底物是多聚-D-賴氨酸、多聚-L-賴氨酸、多聚-L-鳥氨酸、纖連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白。通常，最常使用多聚-D-賴氨酸和多聚-L-賴氨酸。重要的是要注意，當(dāng)使用聚 L-賴氨酸時(shí)，選擇更高的分子量 (>MW 30,000–70,000)，因?yàn)檩^短的聚合物可能對(duì)你的細(xì)胞有毒。此外，確?？椎恼麄€(gè)底部都被底物覆蓋，以避免細(xì)胞生長(zhǎng)不均勻和結(jié)塊。在電鍍神經(jīng)元之前，徹底清洗所有多余的底物，因?yàn)闅埩舻牡孜锟赡軐?duì)神經(jīng)元有毒。

2. 使用胚胎組織

最好使用胚胎動(dòng)物來(lái)培養(yǎng)神經(jīng)元。產(chǎn)前動(dòng)物的大腦 (E16-E18) 的神經(jīng)元具有較少?gòu)V泛的過程和連接，使細(xì)胞在解離過程中不易受到損傷。此外，產(chǎn)前大腦擁有許多未分化的細(xì)胞。當(dāng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，這些細(xì)胞比已經(jīng)分化的細(xì)胞更容易分化成神經(jīng)元。相比之下，較老的腦組織的異質(zhì)性可能會(huì)用其他細(xì)胞類型（如星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞）污染培養(yǎng)物。

3. 充分分離組織

使用酶解、化學(xué)解離和機(jī)械解離的組合正確解離神經(jīng)組織非常重要。如果組織沒有正確解離，可能會(huì)發(fā)生細(xì)胞聚集，使神經(jīng)元難以在培養(yǎng)中形成正確的連接。我們建議在解剖后將神經(jīng)組織進(jìn)一步切成小塊，以幫助分離。此外，請(qǐng)考慮你用于解離的酶。例如，膠原酶比胰蛋白酶更溫和，在解離步驟中可能需要更多時(shí)間。

4. 確保使用含有正確補(bǔ)充劑的無(wú)血清培養(yǎng)基

在你的培養(yǎng)基中添加血清會(huì)導(dǎo)致你的細(xì)胞不正常分化，主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞。用于培養(yǎng)神經(jīng)元的適當(dāng)培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑是市售的。為了避免細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)務(wù)必在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目股?，例如青霉?鏈霉素-谷氨酰胺混合物。此外，當(dāng)最初對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行電鍍時(shí)，培養(yǎng)基中的少量 L-谷氨酸 (~0.025mM) 可以幫助神經(jīng)元生長(zhǎng)和連接。然而，為了避免細(xì)胞毒性，重要的是要了解培養(yǎng)基中的 L-谷氨酸濃度和培養(yǎng)暴露的持續(xù)時(shí)間。最后，為了長(zhǎng)時(shí)間保持健康的培養(yǎng)，我們建議每三天用新培養(yǎng)基更換一半的培養(yǎng)基。

5. 了解適合你實(shí)驗(yàn)的密度

以理想的密度電鍍神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)的整體健康很重要。電鍍細(xì)胞過于密集或過于稀疏都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚集，僅在電鍍幾天后就會(huì)在培養(yǎng)物中產(chǎn)生球狀體。約 1,000–5,000 個(gè)細(xì)胞的密度鋪板 2 。你的文化的理想密度取決于你的實(shí)驗(yàn)問題。例如，在嘗試對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像時(shí)，較低的密度是理想的，但在嘗試對(duì)低表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡時(shí)，可能需要較高的密度。

6. 快速工作

一旦開始準(zhǔn)備神經(jīng)元，細(xì)胞就會(huì)陷入困境并有死亡的危險(xiǎn)！因此，快速有效地工作很重要。確保在開始神經(jīng)元準(zhǔn)備之前準(zhǔn)備好所有解決方案和設(shè)備。此外，考慮加熱溶液以避免極端溫度變化，并在酶解過程中將組織置于 37°C 培養(yǎng)箱中以加速分離。

7. 讓你的文化適應(yīng)新環(huán)境

在鋪板后立即檢查你的細(xì)胞可能很誘人，但神經(jīng)元對(duì)其環(huán)境非常敏感。溫度或攪動(dòng)的變化會(huì)干擾細(xì)胞并阻止它們生長(zhǎng)。最好盡可能讓培養(yǎng)物保持獨(dú)立，只在更換培養(yǎng)基和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療時(shí)打擾它們。

優(yōu)化神經(jīng)元制備方案后，你可以將培養(yǎng)物用于體外技術(shù)，例如免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡、ELISA 或流式細(xì)胞術(shù)。

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