RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一類功能強大而廣泛的調(diào)節(jié)因子，約占細胞編碼的所有蛋白的5%~10%。目前除了少數(shù)RNA以核酶形式單獨發(fā)揮功能，大部分RNA通過與蛋白結(jié)合形成RNA-蛋白復合物來發(fā)揮作用。

RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）是在傳統(tǒng)IP實驗基礎上衍生出的應用，核心用于研究體內(nèi)RNA與蛋白的結(jié)合情況。其原理是基于抗體特異性識別目標蛋白，從而將與蛋白結(jié)合的RNA復合物沉淀下來。

目前，RIP技術(shù)主要有兩大方向：一是明確特定蛋白與RNA之間的結(jié)合對應關系；二是結(jié)合高通量測序技術(shù)，篩選出RBP所調(diào)控靶基因。

樣本裂解液與結(jié)合了抗體的磁珠或樹脂（Beads）進行孵育，通過”抗原-抗體“之間的免疫作用，將“抗體-誘餌蛋白-互作RNA”一起“共沉淀”到Beads上。

洗掉未結(jié)合的RNA后，再將“誘餌蛋白-互作RNA”從Beads洗脫下來，提取洗脫液中的RNA，之后可以用qPCR檢測已知RNA，也可以用二代測序檢測未知RNA。

圖1 RIP實驗原理圖

RIP實驗大致流程：樣本裂解→Input樣品制備→樣本裂解液與抗體孵育（抗原抗體結(jié)合）→proteinA/G磁珠與抗體結(jié)合→RNA免疫共沉淀（RIP）→復合物洗脫→RNA提取→qPCR或測序分析

1 細胞收集

（1）每組細胞收集1-2*10e7個，棄培養(yǎng)基；

（2）用預冷的PBS清洗細胞2-3次，徹底去除培養(yǎng)基成分；

2 細胞裂解

（1）加入0.6-1mL預冷的裂解緩沖液（輝駿貨號：FI8101），在裂解液中預先加入6-10μL蛋白酶抑制劑（輝駿貨號：FI8105）、3-5μL RNA酶抑制劑（輝駿貨號：FI8106），現(xiàn)用現(xiàn)配；

（2）為了更充分裂解，最好冰上超聲至溶液基本澄清；如果無超聲條件，可置于冰上裂解30min，期間每10 min渦旋混勻一次，每次5s；

（3）4℃ 12000 rpm離心15 min，收集上清至新的無RNase的1.5 mL EP管中。

3 Input樣本制備

（1）取30 μL作為蛋白 input，取30 μL作為RNA input；

（2）剩余上清平分為兩份用于RIP實驗（記為實驗組和對照組），置于冰上備用或-80℃保存。

（2）每組加入200 μL漂洗液（輝駿貨號：FI8107），顛倒混勻30次，放磁力架上靜置1 min ，并棄上清；

（3）重復上步操作一次。

5 樣本裂解液與抗體孵育

（1）向樣本裂解液中加入誘餌蛋白抗體或Normal IgG，放混勻儀上室溫孵育1-2 h（或4℃過夜孵育以提高靈敏度）；

（2）洗滌2次去除未結(jié)合抗體（使用漂洗緩沖液）。

6 protein A/G磁珠與抗體結(jié)合

（1）向protein A/G磁珠中加入的樣本-抗體混合物，放混勻儀上4℃孵育2 h；

（2）放磁力架上靜置 1 min 并棄上清；

（3）每組加入500 μL漂洗液，顛倒混勻30次，放磁力架上靜置1 min，后棄上清；

（4）重復上步操作一次；

（5）再次加入500 μL漂洗液，顛倒混勻30次；

（6）取100 μL移入新離心管中用于蛋白檢測（標注為管1），剩余400 μL用于RNA提取（標注為管2），兩管分別放磁力架上靜置1 min 并棄上清，保留磁珠。

7 蛋白Input和誘餌蛋白檢測

（1）向蛋白Input組、管1的磁珠中加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液，95℃加熱5-10 min；

（2）管1放磁力架上靜置1 min，收集上清至新的離心管中，Western Blot檢測誘餌蛋白的表達情況，驗證是否IP成功。

8 RNA提取純化

方案1——試劑盒提取RNA，可按照微量RNA提取試劑盒來提取RNA。

方案2——Trizol法提取RNA

（1）向管2的磁珠中加入1 mL Trizol，室溫靜置5 min；4℃ 12000 g 離心10 min，取上清；

（2）加入0.2 mL氯仿，渦旋混勻或猛烈晃動15 s，室溫放置2~3 min；

（3）4℃ 12000 g離心15 min，吸取水相至新的無RNase1.5 mL EP管中（約可吸取0.5-0.55 mL）；

（4）加入0.5 mL異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫下沉淀10 min或-20℃沉淀過夜；

（5）4℃ 12000 g離心 10 min，管底可見RNA沉淀，棄上清；

（6）加入1 mL 75%乙醇（DEPC水或RNase-free水配制）；

（7）4℃ 12000 g離心10 min，棄上清；5000 g快速離心1 s，小心吸盡液體；

（8）待RNA略干后（靜置3 min），加入20 μL DEPC水或RNase-free水，將RNA洗脫下來，-80℃保存或直接進行反轉(zhuǎn)錄。

注意：①選擇方案1（先洗脫再提取RNA），可能損失部分RNA；②如果RNA含量低，建議選擇方案2（從磁珠上直接提取RNA），提取效率更高，但可能會增加非特異性。

9 RNA分析

提取后的RNA、RNA input可用于qPCR實驗或高通量測序。

1、在實驗設計中，需要有蛋白input組、RNA input組、誘餌蛋白抗體RIP組（實驗組）和IgG抗體陰性對照組（對照組）。

2、全程保持無酶，使用不含RNase的儀器、吸頭和試管，裂解緩沖液和漂洗液中添加RNase抑制劑，防止RNA降解。

3、提取的RNA需無明顯降解（瓊脂糖電泳可見清晰的28S、18S rRNA條帶），且純度達標OD260/280≈1.8-2.0），否則會影響后續(xù)檢測結(jié)果的準確性。

4、RIP后的RNA一般較微量，操作時注意勿把RNA沉淀吸走。

5、切勿讓RNA過分干燥，否則將極難溶解，且測出的A260/A280值會低于1.6。

1 誘餌蛋白檢測結(jié)果

Input組：利用Anti-Bait對樣本裂解液進行WB檢測，驗證Input中是否存在Bait，從而確定蛋白的表達情況以及抗體效果；

IgG組(陰性對照組)：排除非特異性結(jié)合的干擾，normal IgG不能富集Bait，一般不會有Bait條帶，如果有條帶說明Bait與beads或IgG有非特異性結(jié)合，需要重新完善下方法；

IP組(實驗組)：Anti-Bait可以特異性富集Bait，所以一定會有Bait條帶，沒有條帶說明IP實驗失敗，需要復核IP流程，或檢查Anti-Bait是否可以用于IP實驗。

2 待測基因檢測結(jié)果

（1）qPCR檢測（已知目標RNA）

Input組：實驗起始的樣本裂解液，用來校正RNA初始量差異，作為基礎參照；

IgG組（對照組）：normal IgG的RIP產(chǎn)物，用于排除非特異結(jié)合RNA的干擾，驗證結(jié)果特異性；

Anti-Bait組（實驗組）：誘餌蛋白抗體的RIP產(chǎn)物，捕獲與誘餌蛋白結(jié)合的RNA，用于目標檢測。

計算公式：

①計算百分比Input 

%Input=2(-ΔCt[normalized ChIP])x100% 

②與陰性對照比較計算Fold Enrichment（倍數(shù)富集）

ΔΔCt[ChIP/陰性]=ΔCt[normalized ChIP] - ΔCt[normalized 陰性]

Fold Enrichment = 2^(-ΔΔCt[ChIP/陰性])

上圖為RIP陽性結(jié)果示意圖：表明誘餌蛋白可以與獵物RNA特異性結(jié)合，存在相互作用。

（2）高通量測序（RIP-seq，發(fā)現(xiàn)未知結(jié)合RNA）

結(jié)果判斷：測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)（raw data）通過質(zhì)量控制以及過濾，UMI解析和去重、糾錯，獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)（即clean data）。借助比對工具與研究物種的參考基因組進行比對，比對上的序列用于后續(xù)的生物信息學分析（包括read的分布和peak分析）。在全基因組范圍對peak進行掃描，對掃描到的peak進行基因注釋，GO、KEGG Pathway富集分析以及motif分析，深入解析RNA結(jié)合蛋白（RBP）的調(diào)控機制。

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