看文獻(xiàn)時(shí)，面對(duì)蛋白互作的Co-IP免疫共沉淀結(jié)果圖中密密麻麻的條帶和Input、IgG等對(duì)照組，是否總讓你困惑？

輝駿生物帶你拆解條帶彎彎繞繞的奧秘！面對(duì)繁雜的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，陽(yáng)性結(jié)果如何判定？Input、IgG等關(guān)鍵變量又該怎么解讀？輝駿在本文解讀Co-IP實(shí)驗(yàn)的SCI文獻(xiàn)，精準(zhǔn)破解核心疑問(wèn)。無(wú)論是剛?cè)腴T(mén)的科研小白，還是卡在蛋白互作實(shí)驗(yàn)的進(jìn)階研究者，都能收獲CoIP文獻(xiàn)實(shí)用解讀技巧與干貨，輕松搞定Co-IP文獻(xiàn)難點(diǎn)，助力科研高效推進(jìn)。

輝駿生物現(xiàn)在來(lái)解讀一下免疫共沉淀Co-IP結(jié)果圖，可以看到Co-IP的結(jié)果一般分為兩大部分，分別是“Input”部分和“IP”部分。

圖1 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024). 

Input組是直接取細(xì)胞裂解液一部分進(jìn)行WB制樣，所以是總蛋白裂解液，目的是檢驗(yàn)IP前樣品中目的蛋白是否表達(dá)，理論上WB一定能夠發(fā)出來(lái)目的蛋白條帶，如果Input泳道都沒(méi)有目標(biāo)蛋白條帶，說(shuō)明樣品本身有問(wèn)題（比如蛋白沒(méi)提取出來(lái)），后續(xù)IP結(jié)果陰性就沒(méi)有意義；

同時(shí)，Input還能起到內(nèi)參粗略定量的作用。如果某個(gè)樣品的Input信號(hào)明顯偏弱，說(shuō)明其本身目標(biāo)蛋白表達(dá)量就低，那么其IP信號(hào)較弱也是合理的。此外，有些文章會(huì)把Input寫(xiě)成Lysates（裂解液）或者WCL（Whole Cell Lysate），意思是一樣的。

圖中我們可以看到Input里面，利用IB（Immunoblot）也就是WB實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)BXO7、PRMT1都有條帶，并且內(nèi)參β-actin基本齊，說(shuō)明目的蛋白均成功表達(dá)。

接下來(lái)，看IP組：

泳道① IgG指的是陰性對(duì)照，通常用與目標(biāo)蛋白無(wú)關(guān)的非特異性抗體（比如兔 IgG、鼠 IgG）代替特異性抗體，重復(fù)IP操作。它的作用是排除非特異性結(jié)合的干擾，如果 IgG 泳道也出現(xiàn)了目標(biāo)蛋白條帶，說(shuō)明 IP 捕獲的可能是雜蛋白（抗體非特異性吸附）。

泳道②是用FBXO7抗體和bead從樣品中釣出并洗脫下來(lái)的目標(biāo)蛋白（以及可能與目標(biāo)蛋白結(jié)合的其他蛋白）。然后利用IB去檢測(cè)IP產(chǎn)物，IP 泳道如果有條帶，說(shuō)明抗體成功捕獲了目標(biāo)蛋白，條帶越強(qiáng)，說(shuō)明捕獲效率越高。在圖中，F(xiàn)BXO7釣出來(lái)的目標(biāo)蛋白利用FBXO7抗體進(jìn)行IB檢測(cè)，能下拉到PRMT1蛋白，顯示有條帶，說(shuō)明FBXO7與PRMT1存在相互作用。

??當(dāng)研究的目的蛋白缺少好用的IP抗體，或者目的蛋白在細(xì)胞中本底表達(dá)很低時(shí)，很多文章都會(huì)把目的蛋白構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒，并且給目的蛋白帶上標(biāo)簽，常用的標(biāo)簽有：

■ Flag: DYKDDDDK（8個(gè)氨基酸），為了保證更好的識(shí)別效果，實(shí)際常常用到3*Flag標(biāo)簽（即3個(gè)Flag序列串聯(lián)起來(lái)）

■ Myc: EQKLISEEDL（9個(gè)氨基酸）

■ HA: YPYDVPDYA（10個(gè)氨基酸）

■ V5: GKPIPNPLLGLDST（14個(gè)氨基酸）

■ His: HHHHHHHHHH（6-10個(gè)氨基酸）

■ GFP/EGFP/mCherry: 27KD

這樣將表達(dá)載體過(guò)表達(dá)到細(xì)胞中，利用Flag、Myc或HA等抗體，就能很方便的IP外源蛋白，輝駿生物解讀一下結(jié)果圖：

從圖中可以看到泳道①、②、③、④均為對(duì)照組，泳道⑤、⑥為實(shí)驗(yàn)組。Lysates（即Input組）所有轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)對(duì)應(yīng)蛋白條帶，說(shuō)明目的蛋白均成功表達(dá)。

接下來(lái)，看IP組：

用HA抗體特異性下拉誘餌蛋白HA-ASK1后，泳道⑤也能下拉到 His-TRAF6 條帶，說(shuō)明HA-ASK1與 His-TRAF6 存在特異性相互作用；而泳道⑥加入 Flag-MVP 后，His-TRAF6 條帶直接消失，表明過(guò)表達(dá)Flag-MVP會(huì)顯著抑制 ASK1與 TRAF6 的相互作用！