質(zhì)譜是解析蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）核心工具，依托 “特異性富集 - 高分辨檢測 - 智能算法” 體系，可揭示蛋白動態(tài)修飾網(wǎng)絡(luò)，突破低豐度修飾肽段檢測限制、精準(zhǔn)定位調(diào)控位點(diǎn)。液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，可鑒定磷酸化、甲基化、泛素化等已知修飾及小分子藥物蛋白修飾位點(diǎn)。檢測特定蛋白修飾位點(diǎn)前，可通過 IP、親和純化、SDS-PAGE 分離純化目的蛋白，同步檢測 8 種已知修飾。

輝駿生物在本文重點(diǎn)講解 SCI 文獻(xiàn)中 IP-MS 鑒定磷酸化、甲基化、泛素化位點(diǎn)方法，助力實(shí)驗(yàn)高效開展。輝駿生物憑借多平臺檢測技術(shù)，提供樣本處理至深度數(shù)據(jù)分析全流程方案，定制化修飾組學(xué)服務(wù)及跨學(xué)科技術(shù)融合，可提升修飾位點(diǎn)鑒定效率。IP-MS、LC-MS/MS 修飾位點(diǎn)鑒定技術(shù)咨詢及產(chǎn)品訂購可隨時(shí)聯(lián)系！

LC-MS/MS修飾位點(diǎn)技術(shù)流程

（1）樣品制備：提取生物樣品蛋白，IP富集。 （2）蛋白酶解：胰蛋白酶等酶解為肽段。 （3）質(zhì)譜及數(shù)據(jù)分析：LC-MS/MS鑒定，數(shù)據(jù)檢索分析修飾肽段與位點(diǎn)。

LC-MS/MS修飾位點(diǎn)鑒定 * 輝駿客戶案例

IP-MS磷酸化關(guān)鍵位點(diǎn)鑒定

PhosphositePlus顯示KIAA1429存在明顯磷酸化修飾（圖1A）。

IP-MS（輝駿生物提供技術(shù)支持）鑒定其絲氨酸1579位點(diǎn)顯著磷酸化（圖1B）。

過表達(dá)KIAA1429上調(diào)自身泛絲氨酸/蘇氨酸磷酸化（p-S/T）水平（圖1C）。

免疫熒光顯示p-S/T與KIAA1429在細(xì)胞質(zhì)共定位（圖1D）。

序列分析表明KIAA1429的Ser1579位點(diǎn)在多物種中高度保守（圖1E）。

據(jù)此構(gòu)建1579位絲氨酸突變?yōu)楸彼岬馁|(zhì)粒（1579S）（圖1F）。

過表達(dá)突變質(zhì)粒KIAA1429-SA可顯著下調(diào)該位點(diǎn)p-S/T修飾（圖1G）。

免疫熒光顯示KIAA1429核質(zhì)定位存在明顯差異（圖1H）。

本研究經(jīng)數(shù)據(jù)庫預(yù)測、IP-MS篩選及功能驗(yàn)證，證實(shí)KIAA1429的Ser1579可發(fā)生磷酸化，且該修飾是調(diào)控其核質(zhì)分布的關(guān)鍵。

圖1 LC-MS/MS鑒定磷酸化位點(diǎn)

IP-MS甲基化關(guān)鍵位點(diǎn)鑒定

IP-MS發(fā)現(xiàn)PRMT3高度富集HSP60（HSPD1編碼）（圖1A）。

Co-IP證實(shí)二者相互作用（圖1B），免疫熒光顯示互作位于細(xì)胞質(zhì)（圖1C）。

Co-IP表明敲除PRMT3或SGC707處理可抑制HSP60的ADMA修飾（圖1D、1E），過表達(dá)PRMT3則增加其ADMA修飾（圖1F），證實(shí)PRMT3調(diào)控HSP60精氨酸甲基化。

IP-MS（輝駿生物提供技術(shù)支持）確定HSP60唯一甲基化位點(diǎn)為R446（圖1G），該位點(diǎn)多物種保守且匹配甲基化共識基序（圖1H）。

Co-IP顯示Flag-HSP60-RK突變體ADMA修飾消除（圖1I、1J），敲除PRMT3或SGC707抑制可降低HSP60寡聚化（圖1K、1L）。

本研究證實(shí)HSP60是PRMT3新底物，PRMT3通過甲基化其R446位點(diǎn)調(diào)控寡聚化。

圖2 LC-MS/MS鑒定甲基化位點(diǎn)

IP-MS泛素化關(guān)鍵位點(diǎn)鑒定

LC-MS/MS篩選出E3泛素連接酶RNF213與TRIM25（1a）。

TCGA-KIRC及IHC顯示TRIM25在ccRCC中顯著上調(diào)，RNF213無明顯關(guān)聯(lián)（1b、1c）。

功能實(shí)驗(yàn)表明TRIM25促進(jìn)LC3降解（1d、1e）。

CoIP與GST pull-down證實(shí)TRIM25與LC3相互作用（1f、1g）。

K51R突變完全消除LC3B泛素化，確定K51為主要位點(diǎn)（1h）；TRIM25介導(dǎo)LC3B的K63型多泛素化（1i），體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其直接催化作用（1j）。

結(jié)論：TRIM25直接介導(dǎo)LC3B K51位點(diǎn)K63連接型多泛素化。

圖3 LC-MS/MS鑒定泛素化位點(diǎn)

LC-MS/MS蛋白修飾鑒定常見問題

Q1：蛋白修飾鑒定，能鑒定到具體的修飾位點(diǎn)嗎？

蛋白修飾鑒定可以鑒定到具體的修飾肽段和修飾位點(diǎn)，但能否成功鑒定到目標(biāo)蛋白的修飾情況，主要取決于目標(biāo)蛋白的豐度（富集效果）、修飾肽段的豐度等。

Q2：對于不常見的修飾，LC-MS/MS能鑒定到嗎？

可以鑒定。但如果是不常見修飾，需要客戶提供修飾基團(tuán)的分子式和分子量、與哪個(gè)氨基酸反應(yīng)及反應(yīng)式，用于推算出修飾基團(tuán)在連入肽段后的分子式和分子量，以便設(shè)置檢索條件。

Q3：為何質(zhì)譜只測到部分序列，數(shù)據(jù)可信嗎？ 

可信。受酶解回收率、肽段大小、修飾影響酶解、離子化效率限制，僅部分肽段可被檢測；數(shù)據(jù)庫比對打分即可定性蛋白。輝駿生物可提供純度＞95%樣本的蛋白從頭測序服務(wù)。

質(zhì)譜僅需檢測部分蛋白序列即可定性，受酶解回收率、酶切片段大小、修飾影響酶解、肽段離子化效率限制，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對打分輸出可信蛋白。

輝駿生物可提供蛋白從頭測序服務(wù)，要求樣本純度＞95%。

Q4：質(zhì)譜結(jié)果鑒定到很多蛋白，如何評估蛋白的可信度，或者如果篩選蛋白進(jìn)行后續(xù)研究？

輝駿生物提供的鑒定表格含原始與過濾蛋白列表，過濾列表（pep_expect＜0.05）均為可信蛋白，按得分排序，得分越高可信度越高。IP/pull-down實(shí)驗(yàn)中，低豐度功能蛋白得分可能偏低，建議優(yōu)先依據(jù)功能，再參考得分。

LC-MS/MS修飾位點(diǎn)送樣要求 * 輝駿生物交付結(jié)果

IP樣本的質(zhì)譜檢測服務(wù) 

IP富集后，經(jīng)變性或非變性洗脫后得到的蛋白產(chǎn)物，以溶液或膠條形式送樣。

交付結(jié)果 

1.蛋白和肽段鑒定表格（含修飾肽段及修飾位點(diǎn)）；2.質(zhì)譜檢索網(wǎng)頁；3.指定肽段的質(zhì)譜圖；4.質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)；5.實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

★★★ 輝駿生物在IP、Pull down蛋白樣本的質(zhì)譜檢測領(lǐng)域，已積累十余年成熟服務(wù)經(jīng)驗(yàn)。憑借專業(yè)的技術(shù)實(shí)力與嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)把控，客戶已在Nat Commun、Cell Discov、Mol Cancer等國際知名期刊上，成功發(fā)表上百篇SCI論文。如果您有相關(guān)樣本送樣檢測需求，歡迎隨時(shí)聯(lián)系，我們將為您提供高效、可靠的科研技術(shù)支持！

LC-MS/MS蛋白鑒定 * 輝駿生物服務(wù)優(yōu)勢

參考文獻(xiàn)

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[2]Shi Y, Wu Z, Liu S, et al. Targeting PRMT3 impairs methylation and oligomerization of HSP60 to boost anti-tumor immunity by activating cGAS/STING signaling. Nat Commun. 2024;15(1):7930. Published 2024 Sep 10.

[3]Lan W, Chen X, Yu H, et al. UGDH Lactylation Aggravates Osteoarthritis by Suppressing Glycosaminoglycan Synthesis and Orchestrating Nucleocytoplasmic Transport to Activate MAPK Signaling. Adv Sci (Weinh).

廣州輝駿生物（Fitgene）2011年成立，15+年科研服務(wù)經(jīng)驗(yàn)。提供蛋白質(zhì)譜、分子互作、抗體株/基因編輯細(xì)胞株構(gòu)建等服務(wù)，自研納米抗體磁珠、IP二抗、試劑盒等產(chǎn)品。自有實(shí)驗(yàn)平臺，結(jié)果真實(shí)可靠，售前方案專業(yè)，售后支持至文章發(fā)表。

目前，客戶已在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF: 52.7）、Journal of Hematology & Oncology (IF: 40.4)、European Heart Journal (IF: 35.7）、Molecular Cancer (IF: 33.9）、Cell Discovery (IF: 33.5）、Nature Methods (IF: 32.1）等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章。